- Caratterizzazione e profilazione di biomolecole
Il progetto è incentrato sulla caratterizzazione e sullo sviluppo di biomolecole.
Attraverso lo sviluppo e l'acquisizione di conoscenze in chimica e biochimica, le attività si concentrano sullo studio dei problemi legati allo sviluppo e alla valutazione dell'efficacia dei farmaci e dei farmaci biologici, in particolare degli anticorpi monoclonali.
Lo sviluppo e l'ingegnerizzazione di anticorpi per scopi diversi, come la diagnostica o la terapia, richiede una caratterizzazione completa per determinare affinità, specificità e meccanismo d'azione. L'interferometria su biostrato (BLI) è una delle tecniche utilizzate per analizzare le interazioni tra due biomolecole. Pertanto, può aiutare nella caratterizzazione degli anticorpi in modo relativamente semplice e veloce. Nella BLI, il legame tra un ligando immobilizzato sulla punta del biosensore e un analita in soluzione produce un aumento dello spessore ottico sulla punta del biosensore, con conseguente spostamento della lunghezza d'onda proporzionale all'entità del legame (Azmiri e Lee, 2015; Mechaly et al., 2016). Le punte dei sensori raccolgono letture in tempo reale, mentre sono immerse nella soluzione dell'analita ("dip-and-read"), senza la necessità di una fluidica a flusso continuo (Yang et al., 2017). Il sistema consente quindi di misurare diverse interazioni anticorpo-antigene, utilizzando vari sensori, adatti a molecole prive di etichetta o a tag ampiamente utilizzati. Tuttavia, il sistema può essere utilizzato anche per una serie di altre misurazioni che coinvolgono le interazioni proteina-proteina. Ulteriori approcci alla caratterizzazione degli anticorpi prevedono anche l'analisi HPLC di mAb intatti e delle loro varianti e frammenti mediante modalità a scambio ionico, a esclusione dimensionale e a fase inversa e, recentemente, fanno uso anche di tecniche di affinità, interazione idrofobica, modalità mista e HILIC. L'obiettivo del progetto è sviluppare o ottimizzare le tecniche attuali da applicare allo sviluppo di farmaci biologici.
- Biomolecule characterization and profiling
The project is focused on the characterization and development of biomolecules.
By developing and acquiring knowledge in chemistry and biochemistry, activities are focused at studying problems related to the development and evaluation of the efficacy of drugs and biological drugs, in particular monoclonal antibodies.
The development and engineering of antibodies for different purposes, such as diagnostics or therapeutics, requires comprehensive characterization to determine affinity, specificity and mechanism of action. Biolayer interferometry (BLI) is one of the technique used for analyzing interactions between two biomolecules. Thus, it can aid in antibody characterization in a relatively easy and fast manner. In BLI, the binding between a ligand immobilized on the biosensor tip and an analyte in solution produces an increase in optical thickness at the biosensor tip, resulting in a wavelength shift proportional to the extent of binding (Azmiri and Lee, 2015; Mechaly et al., 2016). The sensor tips collect readings in real time, while immersed in the analyte solution (“dip-and-read”), without the need for continuous flow fluidics (Yang et al., 2017). The system therefore allows the measurements of different antibody-antigen interactions, using various sensors, suitable for label-free molecules or widely used tags. However, the system can also be used for a variety of other measurements involving protein-protein interactions. Further approaches to antibody characterization also involve HPLC analysis of intact mAbs and their variants and fragments by ion-exchange, size-exclusion, and reversed-phase modes and recently make use also of affinity, hydrophobic interaction, mixed-mode, and HILIC techniques. The aim of the project is to develop or optimize current techniques to be applied in the development of biologics.
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- HER e cancro
L'obiettivo del progetto è far progredire lo sviluppo di nuovi farmaci biologici innovativi da applicare alla terapia del cancro. L'idea è quella di utilizzare i principi innovativi della Target Therapy e di attaccare le cellule tumorali utilizzando strumenti multipli, come gli anticorpi monoclonali e i BiTE (Bispecific T-cell engagers), attraverso i recettori della famiglia ErbB (o HER), la cui espressione ha una grande importanza nei meccanismi di proliferazione e sopravvivenza di vari tipi di cancro. In particolare, l'azienda Takis ha sviluppato l'anticorpo Rever3mAb e una famiglia di anticorpi correlati, tra cui BiTE e ADC che si legano al recettore ErbB3 (o HER3), bloccandolo, e inducono la morte cellulare in modi diversi. Il progetto prevede l'ulteriore caratterizzazione dei formati anticorpo e BiTE, anche attraverso lo sviluppo di metodi per la loro produzione. Parallelamente, alcune attività saranno dedicate allo sviluppo di biomarcatori per identificare i pazienti che beneficeranno sia di Rever3mAb che del formato BiTE. Come ulteriore strategia, il progetto valuterà l'ipotesi di colpire non solo HER3, ma anche HER2. Infatti, tra i meccanismi di resistenza tumorale vi è la selezione di cloni che non esprimono il recettore bersaglio della terapia attuale. In questo caso, una terapia contro due o più bersagli molecolari ha maggiori probabilità di successo. Ad esempio, Trastuzumab (venduto da Roche con il nome commerciale di Herceptin), è un anticorpo monoclonale umanizzato in commercio in Italia dal 2014. Il bersaglio molecolare del farmaco è HER2/neu, che è patologicamente sovraespresso (ad esempio, per amplificazione del gene codificante) in alcuni tipi di tumore (alcuni istotipi di cancro al seno o allo stomaco). La particolarità di HER2/neu risiede nel fatto che non possiede un dominio in grado di legare una molecola (quindi, non ha un sito recettoriale), sebbene sia dotato di un dominio tirosin-chinasico (intracellulare), che è in grado di trasmettere un segnale di attivazione a valle dopo aver reclutato un'altra proteina HER (dimerizzazione) che svolge la funzione recettoriale. HER3, ad esempio, che dimerizza con HER2, è invece dotato di un sito recettoriale ma manca di un dominio tirosin-chinasico. Trastuzumab si lega a HER2/neu impedendo la sua omo- o eterodimerizzazione; in questo modo la proteina viene "spenta" e il tumore viene privato di un importante fattore di crescita. L'obiettivo è quello di utilizzare l'anticorpo anti-HER2 per verificare l'ipotesi di sinergia con Rever3mab e possibilmente generare un anticorpo bispecifico in grado di riconoscere sia HER2 che HER3.
- HER3 and cancer
The aim of the project is to advance the development of new innovative biological drugs toward application in cancer therapy. The idea is to employ innovative Target Therapy principles and by attacking cancer cells using multiple tools, such as monoclonal antibodies and BiTEs (Bispecific T-cell engagers), through ErbB (or HER) family receptors, the expression of which has great significance on the mechanisms of proliferation and survival of various types of cancer. Specifically, the Takis company has developed the Rever3mAb antibody and a family of related antibodies, including BiTE and ADC that bind to, block the ErbB3 (or HER3) receptor, and induce cell death in different ways. The project will further characterize the antibody and BiTE formats, also by developing methods for manufacturing them. In parallel, some activities will be dedicated to the development of biomarkers to identify patients who will benefit from both Rever3mAb and the BiTE format. As a further strategy, the project will evaluate the hypothesis of targeting not only HER3, but also HER2. Indeed, among the mechanisms of tumor resistance is the selection of clones that do not express the receptor targeted by the current therapy. In this case, a therapy against two or more molecular targets has a higher probability of success. For example, Trastuzumab (sold by Roche under the trade name Herceptin), is a humanized monoclonal antibody that has been on the market in Italy since 2014. The molecular target of the drug is HER2/neu, which is pathologically overexpressed (e.g., by amplification of the coding gene) in certain tumor types (some breast or stomach cancer histotypes). The particularity of HER2/neu lies in the fact that it does not have a domain capable of binding a molecule (thus, it does not have a receptor site), although it is provided with a tyrosine kinase domain (intracellular), which is capable of transmitting a downstream activation signal after recruiting another HER protein (dimerization) that performs the receptor function. HER3, for example, that dimerize with HER2, is instead provided with a receptor site but lacks a tyrosine kinase domain. Trastuzumab binds to HER2/neu by preventing its homo- or heterodimerization; thus the protein is "switched off" and the tumor deprived of an important growth factor. The aim is to use the anti-HER2 antibody to test the synergy hypothesis with Rever3mab and possibly generate a bispecific antibody capable of recognizing both HER2 and HER3.
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- Sviluppo di metodiche di imaging MR quantitativo del midollo spinale
L’imaging cerebrale quantitativo (funzionale e strutturale) con MRI si è affermato come strumento essenziale per la ricerca di base e clinica nel campo delle neuroscienze. L’estensione di tecniche
quantitative al midollo spinale è problematica a causa delle specificità del distretto anatomico (piccola dimensione trasversa, movimento, disomogeneità di campo magnetico associata alle interfacce tra
tessuti). Il progetto si propone di sviluppare approcci MR di carattere morfofunzionale utili per la caratterizzazione della fisiologia e della microstruttura del midollo spinale e traslabili alla pratica clinica, in
particolare per applicazioni a patologie traumatiche e infiammatorie.
- Development of quantitative MR imaging methods of the spinal cord
Quantitative brain imaging (functional and structural) with MRI has established itself as a tool essential for basic and clinical research in neuroscience. The extension of techniques
quantitative to the spinal cord is problematic because of the specificities of the anatomical district (small transverse dimension, motion, inhomogeneity of magnetic field associated with interfaces between
tissues). The project aims to develop morphofunctional MR approaches useful for the characterization of the physiology and microstructure of the spinal cord and translatable to clinical practice, in
particular for applications to traumatic and inflammatory pathologies.
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- Meccanismi delle disfunzioni sinaptiche in patologie motorie ed epilessia
Le sinaptopatie rappresentano un gruppo emergente di disturbi genetici associati a gravi fenotipi
neurologici. In particolare, le forme causate da mutazioni nei geni GNAO1, GNB1, GNAL, ADCY5, PDE10A
e PDE2A, che coinvolgono proteine postsinaptiche appartenenti alla via di trasduzione del segnale dei
recettori accoppiati a proteine G (GPCRs), sono caratterizzate da un'espressione variabile di disturbi del
movimento ipercinetici e ipocinetici, alterazioni del neurosviluppo ed epilessia. Questi geni codificano per
proteine espresse in modo ubiquitario nel sistema nervoso centrale, coinvolte nella via di trasduzione del
segnale dei GPCRs, che regola l'omeostasi del cAMP. La mancanza di una conoscenza approfondita della
via di trasduzione del segnale GPCRs-cAMP e dei meccanismi patogenetici alla base di queste sinaptopatie
ostacola lo sviluppo di terapie efficaci. L’obiettivo del progetto è quello di analizzare in modelli in vitro ed
in vivo l'impatto funzionale delle varianti geniche identificate nei pazienti. Specificamente, verranno
utilizzati induced pluripotent stem cells (iPSC) derivate da fibroblasti di pazienti e modelli di roditori per
valutare l'effetto delle mutazioni sulla funzione sinaptica e per eseguire screening farmacologici. Il
progetto fornirà nuove conoscenze sul ruolo della via GPCRs-cAMP nel sistema nervoso centrale ed un
significativo impulso all’individuazione di farmaci per le sinaptopatie derivanti dalle alterazioni di questa
via, attraverso l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.
- Mechanisms of synaptic dysfunction in movement disorders and epilepsy
Synaptopathies represent an emerging group of genetic disorders associated with severe phenotypes neurology. In particular, the forms caused by mutations in the genes GNAO1, GNB1, GNAL, ADCY5, PDE10A and PDE2A, which involve postsynaptic proteins belonging to the signal transduction pathway of the G-protein-coupled receptors (GPCRs), are characterized by variable expression of disorders of hyperkinetic and hypokinetic movement, neurodevelopmental alterations, and epilepsy. These genes encode for
ubiquitously expressed proteins in the central nervous system involved in the signal transduction pathway of GPCRs, which regulates cAMP homeostasis. The lack of in-depth knowledge of the GPCRs-cAMP signal transduction pathway and the pathogenetic mechanisms underlying these synaptopathies hinders the development of effective therapies. The goal of the project is to analyze in in vitro and in vivo models the functional impact of the identified gene variants in patients. Specifically, they will be used induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from patient fibroblasts and rodent models to
evaluate the effect of mutations on synaptic function and to perform drug screening. The
project will provide new insights into the role of the GPCRs-cAMP pathway in the central nervous system and a significant boost to the identification of drugs for synaptopathies resulting from alterations in this pathway, through the identification of new therapeutic targets.
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- Biodeterioramento batterico e biorisanamento di caverne "storiche" del sottosuolo di Roma (BABIROME)
La Città metropolitana di Roma si estende su una vasta area urbana (5.352 km2) che ospita attività urbane, agricole e industriali. Il territorio è adagiato su rocce vulcaniche e contiene una complessa rete di cavità sotterranee artificiali di varia origine e funzione storica. Molte di queste cavità possono essere fatte risalire al periodo romano, più di duemila anni fa, quando i suoli vulcanici venivano intensamente sfruttati attraverso cave sotterranee per l'approvvigionamento di materiali da costruzione (Ciotoli et al., 2015). Attualmente, la maggior parte di esse è abbandonata a causa del rischio di crolli o cedimenti del terreno (Fasani et al., 2011), anche se alcune sono state recuperate dal degrado da squadre speleologiche urbane e sono aperte al pubblico per visite turistiche. Alcune di queste cavità contengono sorgenti e laghi sotterranei che sono ad alto rischio di esposizione agli inquinanti. In precedenza sono state identificate possibili fonti di inquinamento, tra cui scarichi industriali, metanodotti, depositi di idrocarburi, perdite nei sistemi fognari e acque reflue domestiche, incidentalmente anche dagli ospedali. Le comunità microbiche autoctone sono state guidate anche da diversi fattori, come le condizioni afotiche, l'umidità elevata e costante, la stabilità termica durante tutto l'anno, il tipo di roccia e la presenza di acque sotterranee (Engel et al., 2010; Turrini et al., 2020).
Non è ancora stato studiato in che misura gli inquinanti possano influire sulla struttura delle comunità microbiche delle grotte urbane. L'inquinamento potrebbe influenzare queste comunità, con inquinanti organici che potenzialmente selezionano la presenza di microrganismi degradanti (Chebbi et al., 2017). Questi microrganismi, o consorzi microbici, potrebbero essere in grado di metabolizzare composti recalcitranti come gli idrocarburi, rendendoli interessanti ai fini del biorisanamento. Tuttavia, le informazioni sulle capacità di degradazione degli inquinanti da parte dei microrganismi autoctoni delle grotte sono scarse. Recentemente, utilizzando un profilo metatassonomico del gene 16S rRNA su varie cavità urbane, abbiamo dimostrato che questi ambienti afotici ospitano diverse comunità microbiche, i cui phyla membri sono stati precedentemente descritti nella degradazione degli idrocarburi (dati non mostrati).
Lo scopo di questo progetto è quello di esplorare le potenzialità di biorisanamento delle comunità microbiche autoctone (e degli isolati puri) che abitano le cavità urbane di Roma, utilizzando approcci sia coltura-dipendenti che indipendenti. Gli obiettivi della proposta di dottorato sono i seguenti: 1- Determinare la composizione tassonomica delle comunità microbiche in varie cavità urbane; 2- Isolare potenziali ceppi batterici (o comunità miste) in grado di degradare inquinanti recalcitranti e produrre i relativi metaboliti secondari (ad esempio, biosurfattanti, bioemulsionanti). 3- Studiare i profili metabolici e i meccanismi di degradazione degli inquinanti dei ceppi/comunità promettenti selezionati, utilizzando molteplici metodi fisico-chimici e NGS (ad esempio, gascromatografia, metagenomica e metatranscriptomica). 4- Proporre un metodo sostenibile ed ecologico di biorisanamento per il trattamento di cavità urbane contaminate.
I metodi di NGS e di sequenziamento dell'intero genoma del progetto saranno svolti in collaborazione con il laboratorio GenProbio di Parma (prof. Marco Ventura), mentre la caratterizzazione tassonomica e gli studi genomici saranno eseguiti nell'ambito di collaborazioni esterne con i laboratori diretti dal prof. Valme Jurado (Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologia, Sevilla, Spagna) e dal prof. Ramon Rossella Mora (Istituto Mediterraneo di Studi Avanzati, IMEDEA, CSIC-UIB, Esporles, Spagna).
- Bacterial biodeterioration and bioremediation in historical caves of the Rome underground (BABIROME)
The metropolitan city of Rome spans a large urban area (5.352 km2) hosting urban, agricultural, and industrial activities. The territory is settled on volcanic rocks and contains a complex network of underground man-made cavities of various historical origins and functions. Many of these cavities can be traced back to the Roman period, more than two thousand years ago, when the volcanic soils were intensely exploited through underground quarries for the supply of building materials (Ciotoli et al., 2015). Currently, most of them are abandoned due to the risk of collapse or subsidence of the ground (Fasani et al., 2011), though some have been recovered from degradation by urban speleological teams and are open to the public for tourist visits. Some of these cavities contain underground springs and lakes that are at high risk of exposure to pollutants. Possible sources of pollution have previously been identified, including industrial discharges, methane pipelines, hydrocarbon deposits, leaks in the sewage systems, as well as domestic wastewater, incidentally also from hospitals. Autochthonous microbial communities were also driven by several factors e.g., aphotic condition, high and constant humidity, year-round thermal stability, the type of the rock and the presence of groundwater (Engel et al., 2010; Turrini et al., 2020).
To what extent pollutants can impact the microbial community structure of urban caves has not yet been studied. Pollution could affect these communities, with organic pollutants potentially selecting for the presence of degrading microorganisms (Chebbi et al., 2017). These microorganisms, or microbial consortia, could be able to metabolize recalcitrant compounds such as hydrocarbons, making them attractive for bioremediation purposes. However, information about the pollutant-degrading abilities of autochthonous cave microorganisms is scant. We showed recently using a 16S rRNA gene metataxonomic profiling on various urban cavities that these aphotic environments harbour diverse microbial communities, and its members phyla were previously described in the hydrocarbon degradation (data not shown).
The aim of this project is to explore the bioremediation potentials of autochthonous microbial communities (and pure isolates) inhabiting urban cavities in Rome, using both culture-dependent and -independent approaches. The objectives of the PhD proposal are as follows: 1- To determine the taxonomic composition of microbial communities in various urban cavities; 2- To isolate potential bacterial strains (or mixed communities) capable of degrading recalcitrant pollutants and producing their associated secondary metabolites (e.g., biosurfactants, bioemulsifiers). 3- To study the metabolic profiles and the pollutant-degrading mechanisms of selected promising strains/communities using multiple physicochemical and NGS methods (e.g., gas chromatography, metagenomics, and metatranscriptomics techniques). 4- To propose a sustainable and environmentally friendly bioremediation process for treating contaminated urban cavities.
The project NGS and whole genome sequencing methods will be carried out in collaboration with GenProbio lab in Parma (prof. Marco Ventura), while the taxonomic characterization and genomic studies will be performed within the framework of external collaborations with the labs direct by Prof. Valme Jurado (Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologia, Sevilla, Spain) and Prof. Ramon Rossella Mora (Mediterranean Institute for Advanced Studies, IMEDEA, CSIC-UIB, Esporles, Spain).
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- Meccanismo/i neuroprotettivo/i della neuroglobina sulle funzioni aberranti legate alle malattie neurologiche croniche: il coinvolgimento del metabolismo del colesterolo
Le malattie neurologiche croniche (CND), comprese le malattie neurodegenerative, rappresentano una sfida importante per le società dei Paesi occidentali. Purtroppo, gli attuali trattamenti medici per le CND sono palliativi e non curativi [1]. Esiste quindi un disperato bisogno di terapie modificanti la malattia. Le CND sono disturbi multifattoriali associati a disfunzione mitocondriale, accumulo di proteine dispiegate, squilibrio nel metabolismo del colesterolo, neuroinfiammazione e alterazioni del microbioma intestinale [1,2]. La scoperta della neuroglobina (NGB) rappresenta una nuova sfida per comprendere i complessi meccanismi alla base della neuropatologia della CND e per scoprire nuovi approcci terapeutici. La NGB è una globina endogena neuroprotettiva che migliora diverse caratteristiche della CND, tra cui la funzionalità mitocondriale e la neuroinfiammazione [3]. La sovraespressione di NGB ha potenziali effetti protettivi. Studi precedenti incentrati su stimolatori endogeni (ad esempio, ormoni) ed esogeni (polifenoli di origine vegetale) dei livelli di NGB [3] hanno indicato che la NGB viene rilasciata dai neuroni tramite esosomi nel microambiente extracellulare, dove la NGB agisce come fattore autocrino/paracrino di resilienza cellulare contro lo stress ossidativo. Inoltre, l'aumento dei livelli sierici di NGB è stato messo in relazione con il metabolismo cerebrale.
Difetti nel metabolismo del colesterolo cerebrale sono stati associati a quasi tutte le sindromi neurodegenerative [4]. Finora non sono disponibili dati sulla presunta relazione tra NGB e metabolismo del colesterolo, in particolare nelle malattie neurodegenerative. Pertanto, l'obiettivo generale del progetto di dottorato è scoprire se l'induzione di NGB possa influenzare la rete di regolazione del colesterolo nel cervello e migliorare i sintomi neurodegenerativi.
Come primo obiettivo, il ruolo della sovraespressione di NGB nella modulazione del metabolismo del colesterolo sarà testato in vitro utilizzando cellule differenziate di neuroblastoma umano e murino, rispettivamente SH-SY5Y e N1E-115. Poi, dato che la biosintesi del colesterolo cerebrale è particolarmente attiva negli astrociti, esperimenti simili saranno eseguiti su linee cellulari astrocitiche, come U373 e SV40T. Inoltre, dato che l'omeostasi cerebrale è adeguatamente mantenuta da una fine regolazione del trasporto orizzontale del colesterolo tra astrociti e neuroni [5], l'effetto dell'induzione di NGB sarà valutato anche su co-culture astrociti-neuroni, sia sulla linea cellulare in vitro già descritta che su astrociti e neuroni appena isolati da ratti. Negli esperimenti descritti, tutti i parametri saranno misurati sia a livello biochimico che morfologico.
La letteratura recente suggerisce che la sovraespressione di NGB esercita una neuroprotezione in un modello cellulare della malattia di Parkinson (PD) [6]. Nonostante queste evidenze, nessuno studio sistematico ha valutato l'impatto di NGB sulla fisiopatologia del PD. Abbiamo scelto questa patologia come prototipo di malattia neurodegenerativa.
Pertanto, come secondo obiettivo, verrà studiato l'impatto dell'induzione di NGB in due modelli cellulari di PD ben consolidati. In particolare, le cellule SH-SY5Y che sovraesprimono NGB e le cellule N1E-115 trattate con induttori di NGB saranno trattate con rotenone per provocare un fenotipo simile a quello parkinsoniano [6], e gli effetti della sovraespressione di NGB sul metabolismo del colesterolo saranno valutati rispetto alle stesse cellule con un livello normale di NGB. Come descritto in precedenza, tutti i parametri saranno misurati sia a livello biochimico che morfologico.
Infine, come terzo obiettivo, il potenziale impatto terapeutico di NGB sulla fisiopatologia del PD sarà testato in vivo su un modello murino di PD indotto da rotenone. In particolare, topi wild-type (C57BL/6J) e topi che sovraesprimono la neuroglobina (B6.Cg-Tg(CAG Ngb,-EGFP)1Dgrn/J) saranno trattati per via orale con rotenone o veicolo per 6 settimane, come precedentemente riportato [7]. L'attività locomotoria e comportamentale sarà valutata mediante test funzionali. Inoltre, al termine del trattamento con rotenone, gli animali saranno sacrificati. Il cervello verrà prelevato e verranno misurati diversi parametri relativi al metabolismo del colesterolo e ai marcatori di PD, sia dal punto di vista biochimico che morfologico.
I dati ottenuti nel corso di questo progetto di dottorato forniranno nuove conoscenze sul ruolo neuroprotettivo della NGB e sulla sua capacità di modulare il metabolismo del colesterolo, che è già stato dimostrato essere coinvolto nella neurodegenerazione.
- Neuroprotective mechanism(s) of neuroglobin on aberrant functions related to chronic neurological diseases: the involvement of cholesterol metabolism
Chronic neurological diseases (CNDs), including neurodegenerative diseases, represent major challenges for societies in Western countries. Unfortunately, current medical treatments for CNDs are palliative and not curative [1]. Thus, there is a desperate need for disease-modifying therapies. CNDs are multifactorial disorders associated with mitochondrial dysfunction, accumulation of unfolded proteins, imbalance in cholesterol metabolism, neuroinflammation, and changes in the gut microbiome [1,2]. The discovery of neuroglobin (NGB) presents a new challenge to understand the complex mechanisms underlying CND neuropathology and to discover novel therapeutic approaches. NGB is an endogenous neuroprotective globin that ameliorates several CND hallmarks, including mitochondrial functionality and neuroinflammation [3]. NGB overexpression has potential protective effects. Previous studies focused on endogenous (e.g., hormones) and exogenous (plant-derived polyphenols) enhancers of NGB levels [3] indicated that NGB is released by neurons via exosomes in the extracellular microenvironment, where NGB acts as an autocrine/paracrine factor of cell resilience against oxidative stress. In addition, increased NGB serum levels have been related to brain metabolism.
Defects in brain cholesterol metabolism have been associated with almost all neurodegenerative syndromes [4]. So far, no data are available on the putative relation between NGB and cholesterol metabolism, particularly in neurodegenerative diseases. Therefore, the general aim of the PhD project is to uncover whether NGB induction may influence the brain's cholesterol regulatory network and ameliorate neurodegenerative symptoms.
As a first goal, the role of NGB overexpression in modulating cholesterol metabolism will be tested in vitro using human and mouse differentiated neuroblastoma-derived cells, SH-SY5Y and N1E-115, respectively. Then, since brain cholesterol biosynthesis is particularly active in astrocytes, similar experiments will be performed on astrocytic cell lines, such as U373 and SV40T. Moreover, given that brain homeostasis is properly maintained by a fine regulation of cholesterol horizontal transport between astrocytes and neurons [5], the effect of NGB induction will also be assessed on astrocyte-neuron co-cultures, both on the in vitro cell line already described and on freshly isolated astrocytes and neurons from rats. In the described experiments, all the parameters will be measured both biochemically and morphologically.
Recent literature suggests that NGB overexpression exerts neuroprotection in a cell model of Parkinson's disease (PD) [6]. Despite this evidence, no systematic studies have evaluated the impact of NGB on PD pathophysiology. We selected this pathology as a prototype of neurodegenerative disease. Therefore, as a second goal, the impact of NGB induction in two well-established cell models of PD will be investigated. In particular, SH-SY5Y overexpressing NGB and N1E-115 cells trated with NGB inducers will be treated with rotenone to provoke a Parkinsonian-like phenotype [6], and the effects of NGB overexpression on cholesterol metabolism will be assessed compared with the same cells with the normal NGB level. As described before, all the parameters will be measured both biochemically and morphologically.
Finally, as a third goal, the putative therapeutic impact of NGB on PD pathophysiology will be tested in vivo on a rotenone-induced mouse model of PD. In particular, wild-type mice (C57BL/6J) and mice overexpressing neuroglobin (B6.Cg-Tg(CAG Ngb,-EGFP)1Dgrn/J) will be orally treated with rotenone or vehicle for 6 weeks, as previously reported [7]. Locomotor and behavioral activity will be assessed by functional tests. Moreover, at the end of the rotenone treatment, the animals will be sacrificed. Brains will be collected, and several parameters related to cholesterol metabolism and markers of PD will be measured both biochemically and morphologically.
The data obtained during this PhD project will provide new insights into the NGB-dependent neuroprotective role and its ability to modulate cholesterol metabolism, which has already been shown to be involved in neurodegeneration.
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- TEMATICA GENERICA DEL DOTTORATO
Temi di ricerca specifici del corso di dottorato
- Generic PhD topic
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- TEMATICA GENERICA DEL DOTTORATO
Temi di ricerca specifici del corso di dottorato
- Generic PhD topic
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